BioWill?Lab悬浮培养CHO细胞及表达蛋白
时间是：2021-10-10 09:24:00 点击次数：500
一、前期准备
1、 接种前五天左右，开始复苏准备种子细胞。
2、 接种前四天左右，确认相关操作具体执行情况，如：测糖试剂盒、计数板、灭菌的培养基和葡萄糖及NaHCO3并做检菌（无菌检验，4天后如若无菌即可用）、气体钢瓶等。PBS 800ml电极灭菌用；无检过的细胞培养液5L及浓缩液500ml；300ml 7.5%NaHCO3及200g/L葡萄糖溶液300ml，储存于4℃，在使用时提前放入37℃恒温室预热。
3、 接种前三天，各气体及减压阀管路准备,管子用耐压管。
4、 接种前两天，电极校准（准备4.01和7.0的校准液放于室温、两根精度0.1的温度计、饱和Na2SO3溶液、两杯冷、热水，操作详见说明书）。包好锡箔纸，放进灭菌罐里，孔对准，灭菌罐包好锡箔纸高压灭菌。冷却后，待用。
5、 接种前两天，袋子检查，所有耗材记录批次、充气检漏（将所有卡板卡死，塑料螺丝拧紧，充气充到手指几乎压不下去），至少检8h。
6、 接种前两天，接头、接种瓶、碱瓶、葡萄糖瓶等瓶塞管路接头制备及灭菌。
7、 接种前一天装罐，在超净台内装好PH、DO、T电极，并在台内连好酒精袋和取样器，装罐（详见说明书），检漏。
8、 接种前一天，打入500ml不含双抗的培养基到激流袋内开启自动运行，只通低速空气，维持系统正压，检菌24h。
二、细胞接种
9、 准备好细胞种子活率95%以上，密度为2.0×10E6 cells/ml，500ml打入无菌的接种瓶内，置于37度培养箱内。经检菌确认无污染打出培养液，打入种子细胞，留少许检菌，设置好参数，启动自动运行状态。
10、参数设置（PH:7.0-7.2,DO:30%-60%,T:37℃，转速：75-85rpm），细胞培养开始后，20分钟左右取样测糖和计数，作为初始含糖量和细胞密度的起始值。
三、细胞生长期
11、前期培养（1-3天），一般24h取样测糖和细胞计数一次，后期培养（4-6天），一般12h取样测糖和计数一次，计算出24小时内的耗糖量，并做出未来12小时的耗糖预测，并提前准备补充培养基和葡萄糖，一般维持培养液的残糖在2g/L以上。计划好每次细胞计数后补充的培养液的量，尽量采用密度和体积同时上升，最终细胞生长密度和体积差不多同时到达最大值。每次补加培养液不宜过多，以免细胞密度稀释过低导致生长不起来。
四、蛋白表达期
12、当细胞培养到后期，细胞量达到一定，开始给予外界条件提高表达。一般提高表达的方式有：1、降温（28-32度）2、DMSO等试剂。根据耗糖情况适当补充浓缩液和葡萄糖补充营养。
五、下罐
13、当细胞活率低于80-85%时，代谢产物慢慢积累，乳酸含量会增加，可以考虑下罐，检测每天取样的蛋白含量和后期纯化。
