一、实验背景:
用BioWill™SUS-50L生物反应器培养Marc-145细胞并接种PRRSV,检测毒价
二、培养条件(实际操作中的控制参数)
设备型号:BioWill™SUS-50L生物反应器
纸片载体:800g
细胞接种量:8*10E9 cells(9个10L转瓶的细胞)
1、细胞生长液:DMEM+8%FBS+1%PS
细胞生长期DO:50%
细胞生长期pH :7.2
细胞生长期T:37℃
培养时间:96h
2、接种蓝耳病毒培养
细胞维持液:DMEM(高糖)+2%FBS+1%PS
病毒繁殖生长期DO:60%
病毒繁殖生长期pH:7.4
病毒繁殖生长期 T:35℃
接毒量:TCID
50为6.5的种毒1000ml,MOI:
培养时间:48h
三、简述培养过程
接种/培养过程:打出罐内浸泡电极和纸片载体的无菌PBS,打入培养基40L,调节合适参数,预培养24h做无菌检验。接种种细胞,并测原始糖浓度;接种后每24h测糖,48h时开始每天换液来维持细胞生长,根据耗糖量进行换液量。
接毒/培养过程:将培养基打出,然后将含2%血清的培养基40L打到反应器中并加热到35℃,TCID50为6.5的种毒1000ml反应器接毒,接毒24h后取样测糖,根据实际情况补加糖和浓缩包。
取样/收毒过程:接毒24h取样测糖、毒价,每隔2h取毒样一次,每次取冻存2份;细胞病变脱落开始收毒冻融。
四、培养的耗糖检测:
实验数据如下:
时间h |
耗糖量g/d |
耗碱量L/d |
备注 |
0 |
0 |
0 |
接种细胞 |
24 |
40 |
0.35 |
|
48 |
93 |
0.79 |
换生长液30L |
72 |
116 |
1.56 |
换生长液40L |
96 |
140 |
1.81 |
换维持液40L,接毒1L |
120 |
157 |
2.24 |
补(2*DMEM+150g糖/瓶)1L |
144 |
146 |
1.96 |
补(2*DMEM+150g糖/瓶)0.7L |
耗糖曲线图如下:
耗碱曲线图如下:
五、总结与分析(出现的问题及解决方法)
(一)结果
接毒毒价检测结果:
时间
(h) |
种毒 |
26 |
30 |
32 |
34 |
36 |
38 |
40 |
42 |
44 |
48 |
滴度 |
6.5 |
|
|
7.37 |
7.9 |
8.5 |
8.03 |
7.0 |
|
|
|
注: 红色数字为毒价最高点
(二)分析
1、整个培养过程共用:生长液110L,维持液40L,双抗1.2L,谷氨酰胺1L,血清9.6L,浓缩液1.7L,碱8.71L,葡萄糖300g,收获毒液45L,最高毒价在36h为8.5。
2、本次使用的种毒毒价为6.5,最高毒价出现在36h,为8.5。病毒滴度显著提高。
3、本次反应器细胞准备期间,使用的为草原绿野特级新生牛血清,上罐前细胞状态正常,耗糖正常,上罐后血清量为8%,维持液为2%。
(三)问题及解决办法
由于客户工艺信息需要保密,故部分数据做删除。