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反应器培养CHO细胞表达一种融合蛋白
时间:2021-10-08 06:04:55
一、实验背景
摇瓶培养:玻璃三角瓶内传代培养,30ml摇瓶接种密度是:0.8×10E6 cells/ml,传代时间两天左右
摇瓶产量:密度每天倍翻,一般长到在4-6×10E6,30ml,最高长到6-8×10E6,表达量200-300ug/ml左右,扩大体积培养后蛋白产量下降。
二、培养条件(实际操作中的控制参数)
设备型号:BioWill™Lab-5L生物反应器             
细胞名称(注明来源):CHO工程细胞,自己转染构建的
蛋白名称(注明胞内或分泌):一种融合蛋白,胞外分泌型
接种细胞数:0.8×10E6 cells/ml,1000ml
细胞生长期培养液(糖含量):HyQ SFM4CHO,6.74g/L
接种后细胞维持培养液:
细胞生长期DO:50%                     
细胞生长期pH : 7.2               
细胞生长期T:37℃                      表达期T:34℃
转速度:60rpm
细胞培养期:  共6天
表达培养期:共4天
收获体积:3L
三、简述过程
   接种过程:准备好细胞种子密度为0.8×10E6 cells/ml,活率90%,1000ml打入接种瓶内,置于37度培养箱内。在层流罩连上接种瓶打入种子细胞,留少许检菌,设置好参数,启动自动运行状态,每天根据细胞密度、残糖量、渗透压补加培养基、浓缩液和碱。
   表达过程:到后期,细胞密度和体积到达要求后,降温转表达。
四、培养的耗糖检测:
 
培养时间/d
体积/ml
糖耗g/L/24h
备注/ml
1
500
0
接种
2
1000
1.43
补500培养基
3
1100
1.69
补碱100
4
2100
2.22
补1000培养基
5
2600
2.91
补500培养基
6
2700
3.37
补碱100
7
2700
3.55
降温到34度
8
2850
3.44
补100浓缩液、碱50
9
2950
3.50
补100浓缩液、碱50
10
3000
3.34
收获
 
耗糖曲线图(附上曲线图):
 
五、蛋白表达检测:
1、每天取样后做ELISA检测蛋白表达曲线如下
 
六、实验总结与分析(实验中出现的问题及解决方法)
1、细胞培养过程中每天取样,观察细胞状态,检测残糖及渗透压,计数及活率,根据细胞密度及耗糖补加培养基和浓缩液。细胞增殖正常,活率正常。
2、蛋白表达伴随整个细胞生长过程,当活率低于80%时收获下罐,以免其他代谢杂质增多不利于后期蛋白分离纯化。
3、在生物反应器上扩大培养后,细胞达到体积大规模的同时密度明显提高,且工艺参数(相比于摇瓶)控制更稳定,表达量也能明显提高。
4、后期补加的培养基及浓缩包,由于配制放置时间过久,可能多肽及谷氨酰胺等营养物质有部分分解,导致影响后期细胞生长及蛋白表达,存在进一步优化工艺的空间。
七、客户意见(针对产品或需要改进的地方)
1、满意。
2、由于客户工艺信息需要保密,部分数据删除,本总结仅做工艺分析总结用。

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