一、实验背景
摇瓶培养:玻璃三角瓶内传代培养,30ml摇瓶接种密度是:0.8×10E6 cells/ml,传代时间两天左右
摇瓶产量:密度每天倍翻,一般长到在4-6×10E6,30ml,最高长到6-8×10E6,表达量200-300ug/ml左右,扩大体积培养后蛋白产量下降。
二、培养条件(实际操作中的控制参数)
设备型号:BioWill™Lab-5L生物反应器
细胞名称(注明来源):CHO工程细胞,自己转染构建的
蛋白名称(注明胞内或分泌):一种融合蛋白,胞外分泌型
接种细胞数:0.8×10E6 cells/ml,1000ml
细胞生长期培养液(糖含量):HyQ SFM4CHO,6.74g/L
接种后细胞维持培养液:
细胞生长期DO:50%
细胞生长期pH : 7.2
细胞生长期T:37℃ 表达期T:34℃
转速度:60rpm
细胞培养期: 共6天
表达培养期:共4天
收获体积:3L
三、简述过程
接种过程:准备好细胞种子密度为0.8×10E6 cells/ml,活率90%,1000ml打入接种瓶内,置于37度培养箱内。在层流罩连上接种瓶打入种子细胞,留少许检菌,设置好参数,启动自动运行状态,每天根据细胞密度、残糖量、渗透压补加培养基、浓缩液和碱。
表达过程:到后期,细胞密度和体积到达要求后,降温转表达。
四、培养的耗糖检测:
培养时间/d
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体积/ml
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糖耗g/L/24h
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备注/ml
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1
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500
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0
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接种
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2
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1000
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1.43
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补500培养基
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3
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1100
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1.69
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补碱100
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4
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2100
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2.22
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补1000培养基
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5
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2600
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2.91
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补500培养基
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6
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2700
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3.37
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补碱100
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7
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2700
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3.55
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降温到34度
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8
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2850
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3.44
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补100浓缩液、碱50
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9
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2950
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3.50
|
补100浓缩液、碱50
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10
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3000
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3.34
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收获
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耗糖曲线图(附上曲线图):
五、蛋白表达检测:
1、每天取样后做ELISA检测蛋白表达曲线如下
六、实验总结与分析(实验中出现的问题及解决方法)
1、细胞培养过程中每天取样,观察细胞状态,检测残糖及渗透压,计数及活率,根据细胞密度及耗糖补加培养基和浓缩液。细胞增殖正常,活率正常。
2、蛋白表达伴随整个细胞生长过程,当活率低于80%时收获下罐,以免其他代谢杂质增多不利于后期蛋白分离纯化。
3、在生物反应器上扩大培养后,细胞达到体积大规模的同时密度明显提高,且工艺参数(相比于摇瓶)控制更稳定,表达量也能明显提高。
4、后期补加的培养基及浓缩包,由于配制放置时间过久,可能多肽及谷氨酰胺等营养物质有部分分解,导致影响后期细胞生长及蛋白表达,存在进一步优化工艺的空间。
七、客户意见(针对产品或需要改进的地方)
1、满意。
2、由于客户工艺信息需要保密,部分数据删除,本总结仅做工艺分析总结用。